اپتیک و فوتونیک، چگونه بیماری کووید-19 را به مبارزه می‌طلبد؟

 

از تعیین توالی ژنوم ویروس کرونا،Sars- coV-2  و استفاده از LED های فرابنفش در تهویه هوا تا تست‌های تشخیصی مبتنی بر طیف‌سنجی مانند تستهای در لجظه PCR، وجود اپتیک و فوتونیک امکان مبارزه با بیماری کووید-19 را فراهم کرده است.

شکل 1: نمایش طرحواره فعال‌سازی فلوروفور طی آزمایش PCR که P علامت پلیمراز،F فولوروفور و Q علامت مولکول خاموش شده است.

بیماری کووید-19، در یک سال گذشته و در میان تمام اتفاقات تاریخ معاصر جهان، اثر برجسته‌تری را بر زندگی روزانه مردمان گذاشته است. با ادامه‎ی روند شیوع و همه‌گیری بیماری در جهان، عموم مردم آخرین تحولات در آزمایش، تشخیص، درمان، روش‌های ضدعفونی و پیشرفتهای تولید واکسن را بیش از گذشته، از نزدیک دنبال کرده‌اند. شگفت آنکه با وجود این همه توجه به موضوع، در میان رسانه‌ها توجه کمی به این واقعیت وجود داشته است که بسیاری از این پیشرفت‌ها بدون دانش و فناوری‌های فوتونیک امکان‌پذیر نبوده است.

وقتی از نقش فناوری فوتونیک در بیماری کووید-19 صحبت می‌شود، این عبارت که «فوتونیک یک فناوری توانمندکننده است»  به‌عنوانی عبارتی که مکررا در مجامع علمی این حوزه مطرح می‌شود، بی‌مورد به نظر نخواهد رسید؛ چرا که پزشکی به‌عنوان یکی از بخش‌هایی شناخته می‌شود که به‌شدت و به‌صورت بلامنازع تحت تاثیر فوتونیک است. در حقیقت می‌توان ادعا کرد که هیچ صنعتی بیشتر از مراقبت‌های بهداشتی تحت تاثیر شدید فوتونیک قرار نداشته است و در مقایسه شاید تنها بتوان صنعت مخابرات را استثنا کرد. در نتیجه، به‌جا است تا غور و غوضی داشته‌باشیم در این که چطور فناوری فوتونیک در ستیز و مهار پاندمی کووید-19 کمک می‌کند. این مقاله ضمن بررسی کاربردهای جاری فوتونیک در آزمایش تشخیص کووید-19، نگاهی به چگونگی تقویت فناوری‌های نسل آینده این مقوله توسط فوتونیک، در افق 2021 دارد.

نقش تابش فلورسانس در آزمایش تشخیص کووید-19

برای تشخیص عفونت‌های فعال بیماری کووید-19، دستورالعمل‌های بهداشتی برای آزمایش اولیه شامل فرآیندی می‌شود که به‌عنوان واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با رونویسی معکوس [1](rt-PCR) یا «پی‌سی‌آر» شناخته می‌شود.  از آنجا که «پی‌سی‌آر» روشی برای تقویت نمایی «دی‌ان‌اِی» است، مهم است که ابتدا ساختار اولیه یک مولکول «دی‌ان‌ای» برای درک بهتر عملکرد فرآیند بررسی شود. «دی‌ان‌اِی» یک مولکول دو رشته‌ای است که دارای چهار نوکلئیک اسید است: آدنین(A)، سیتوزین (C)، گوانین (G) و تیمین (T). برای تشکیل جفت‌های پایه، برای تولید کدهای 4 بیتی ژنومیک که خود همتاسازی «دی‌ان‌اِی»[2] را تسهیل می‌کنند، آدنین می‌تواند تنها به تیمین متصل شود و کوانین فقط می‌تواند با سیتوزین پیوند برقرار کند.

 در تستهای «پی‌سی‌آر» مرسوم، یک رشته «دی‌ان‌ای» را تغییر ماهیت می‌دهند یا به اصطلاح «دناتوره» می‌کنند. در این حالت «دی‌ان‌اِی» بازشده و به دو نیمه تقسیم می‌شود. سپس، یک پلیمراز به همراه یک آغازگر با کد «دی‌ان‌اِی» که برای ژنوم مورد نظر طراحی شده است اضافه می‌شود. پلیمراز یک فرآیند شیمیایی را آغاز می‌کند که توسط آن دو نیمه سویه «دی‌ان‌اِی» هرکدام با اسید نوکلئیک مناسب پر می‌شوند و دو مولکول «دی‌ان‌اِی» کامل ایجاد می‌کنند. این فرآیند تکرار می‎شود تا چهار مولکول، سپس 8 تا، بعد 16 مولکول ساخته شود و به همین ترتیب ادامه می‌یابد تا تعداد «دی‌ان‌اِی»ها به صورت نمایی افزایش یابد. این تقویت تنها در صورتی اتفاق می‌افتد که توالی «دی‌ان‌اِی» پایه با آغازگر مطابقت داشته باشد. به این ترتیب این روش به یک روش سنجش انتخابی قوی برای تایید وجود یک آنتی‌ژن خاص ،مثل سارس-کووی-2 که به‌عنوان ویروس عامل بیماری کووید-19 شناخته می‌شود، تبدیل شده است. باید به این نکته توجه کرد که از آنجا که ویروس کرونا، یک ویروس «آر‌ان‌اِی» تک رشته‌ای است، گام‌هایی اضافی برای تبدیل «آر‌ان‌اِی» به «دی‌ان‌اِی» بایستی برداشته شود، بنابراین نیاز به رونویسی معکوس است؛ با این‌حال نتیجه همچنان یکی است.

یک پروب «آر‌ان‌اِی» کوچک با یک فلوروفور اکه به یک سر آن پیوند یافته و یک مولکول خاموش کننده[3] که به انتهای دیگر آن متصل است، برای نشان‌گذاری هدف «دی‌ان‌اِی» مورد استفاده قرار می‌گیرد. وقتی مولکول خاموش‌کننده در نزدیکی فلوروفور قرار می‎گیرد، آن‌ را غیرفعال و آن را در محلول بی‌اثر می‌کند، اما پلیمراز بعد از پیوند با «آر‌ان‌اِی»، باعث آزاد شدن فلوروفور و فعال شدن آن می‌شود (شکل 1 را ببینید). همان‌طور که فرایند «پی‌سی‌آر» تکرار می‌شود سیگنال فلورسانس به‌تدریج برای آشکارسازی به‌اندازه کافی تقویت می‌شود. بنابراین هر سیستم آزمایش «پی‌سی‌آر» نیاز به منبع برانگیختگی (نوعا یک LED)، یک آشکارساز نوری و یک فیلتر نوری چندگانه دارد.  

تشخیص آنتی‌بادی هم ابزاری قدرتمند برای تعیین آلودگی قبلی افراد و ردیابی اثر واکسن است. در حال حاضر سنجش ایمنی جاذب مرتبط به آنزیم (اِلایزا)[4] یک استاندارد طلایی برای آزمون آنتی‌بادی است. روش الایزا  شامل یک آنتی‌ژن است که از طریق آنتی‌بادی متصل به یک زیرلایه، بی‌حرکت شده است، این ساختار به‌طور معمول در چاه آرایه میکروپلیت قرار گرفته است. این ترکیب وقتی در معرض نمونه قرار می‌گیرد در صورت وجود آنتی‌بادی در سرم، به آنتی‌ژن متصل می‌شود. سپس یک آنتی‌بادی ثانویه متصل به یک مولکول گزارشکر به چاه اضافه می‌شود تا بتواند با استفاده از رنگ‌سنجی با فورسانس کار تشخیص را انجام دهد. بنابراین سیستم‌های آزمایش الایزا، مانند سیستم‌های آزمایش «پی‌سی‌آر» نیاز به قطعات اپتیکی دارند.

در نتیجه هر آزمون آنتی‌ژن رونویسی معکوس پی‌سی‌آر و آزمایش آنتی‌بادی الایزا برای تشخیص بیماری کووید-19 به صورت مستقیم با فوتونیک وابسته نیست و به‌جای آن، اساسا در بطن آن‌ها وجود یک تجزیه و تحلیل نوری نهفته است. 

توسعه غربالگری سریع قابل انجام در بالین بیمار[5]

ارزش آزمایشهای «پی‌سی‌آر» و  الایزا را نمی‌توان نادیده گرفت، اما متاسفانه هیچ‌کدام از این دو روش برای انجام آزمایش‌های سریع در بالین بیمار مناسب نیستند. برای مثال حتی در الایزا که نوعا در 96 صفحه تخت چاه‌دار انجام می‌شود و امکان آزمایش تعداد زیادی نمونه را به‌طور هم‌زمان فراهم می‌کند، به سبب وجود زمان نهفتگی نمونه‌ها، کل مراحل اندازه‌گیری ساعت‌ها طول می‌کشد. خوشبختانه حتی قبل از همه‌گیری کنونی، روش‌های طیف‌سنجی نوین راه‌های تشخیص پزشکی در بالین بیمار را بازکرده بود. دو تا از امیدبخش‌ترین روش‌های غربالگری در بالین بیمار شامل حس‌گرهای تشدید پلاسمون سطحی[6] و ایمنی سنجی با روش اسپکتروسکوپی رامان ارتقا یافتته سطحی[7] هستند.

تشخیص آنتی‌بادی در بالین بیمار با استفاده از حس‌گرهای  تشدید پلاسمون سطحی، SPR

پلاسمون‌های سطحی موج‌های سطحی‌ای هستند که با نوسانات همدوس نوار رسانش الکترون‌ها در محل فصل مشترک بین یک فلز و یک دی‌الکتریک ساخته می‌شوند. بنابراین، پلاسمون‌های سطحی به‌شدت نسبت به تغییرات ثابت دی‌الکتریک مواد که معادل ریشه مربع ضریب‌شکست است، حساس هستند. به این ترتیب، حس‌گرهای تشدید پلاسمون سطحی به‌سرعت تغییرات ثابت دی‌الکتریک را با روش‌های سنجش ضریب‌شکست، تداخل‌سنجی یا طیف‌سنجی اندازه‌گیری می‌کنند.

حس‌گرهای تشدید پلاسمون سطحی با روش ایجاد لایه‌نشانی یک فیلم فلز کمیاب نازک (مانند طلا، نقره و مس) بر روی یک زیرلایه شیشه‌ای ساخته می‌شوند. سپس آنتی‌ژن می‌تواند با استفاده از یک ساختار بیوشیمیایی مانند آنچه برای الایزا (ELISA) توضیح داده شد به سطح فلزی متصل شود. با اتصال آنتی‌بادی به آنتی‌ژن در سطح حس‌گر، در اثر هر تغییر در فرکانس تشدید پلاسمون‌های سطحی، ثابت دی‌الکتریک اندکی تغییر می‌کند. بنابراین تشدید پلاسمون سطحی از آنجا که نیاز به اتصال ثانویه ندارد می‌تواند امکان تشخیص بدون برچسب را فراهم کند.

شکل 2 طرحواره ای از حس‌گر تشدید پلاسمون سطحی، SPR، مبتنی بر شکست نور لیزر را نشان می‌دهد. در حالی‌که این نمودار برای افزایش درک ساده از فرآیند مفید است، طیف‌سنجی باند پهن یک روش بسیار رایج برای اندازه‌گیری تغییر ضریب شکست است. از آنجاکه در میان خطوط طیف نوری، به‌سبب تداخل غیرسازنده ناشی از نور فرودی در محل پلاسمون‌های سطحی، طیف دارای فرورفتگی است، مینیمم محلی طیف عبوری، همان‌طور که حس‌گر آنالیت بیشتر و بیشتری جمع‌آوری می‌کند جابه‌جا می‌شود و امکان مقداریابی با حساسیت زیاد را فراهم می‌کند.

شکل 2:نمایش طرحواره حس‎گرتشدید پلاسمون سطحی عملیاتی برای تشخیص آنتی‌بادی ضد ویروس سارس-کووی-2

در آپریل سال 2020، یک گروه تحقیقاتی زیر نظر ژان- فرانسوا ماسون، استاد شیمی دانشگاه مونترال و مدیر ارشد فناوری در  Affinité Instruments ( هردو در مونترال، کبک، کانادا) به‌طور موفقیت‌آمیز نشان داد تشدید پلاسمون سطحی وسیله‌ای برای تعیین کمّی آنتی‌بادی سارس-کووی-2 موجود در سرم رقیق نشده است. وسیله استفاده شده برای تجزیه تحلیل‌های انجام شده توسط ماسون و همکارانش در آفینیتی یک حس‌گر تشدید پلاسمون سطحی قابل حمل و متحرک، با عنوان P₄-SPR است (شکل 3 را ببینید). حس‌گر P₄-SPR برای تجزیه و تحلیل مایعات زیستی خام مانند پلاسمای خون یا سرم خون، که بدون پیش‌پردازش مستقیما به دستگاه تزریق می‌شود طراحی شده است. این روش فرآیند آزمایش را بسیار ساده و برای تکنسین‌های این حوزه بسیار شهودی‌تر می‌سازد. علاوه بر این، از آنجا که حس‌گر تشدید پلاسمون سطحی یا SPR قابل حمل دارای ابعادی در حد mm 55×155×175 و وزنی کمتر از kg 3/1 است، و قابلیت حمل همراه با توانایی اندازه‌گیری مستقیم سرم را دارد، برای آزمایش آنتی‌بادی در بالین بیمار ایده‌آل شده است.

شکل 3:سیستم تشدید پلاسمون سطحی قابل حمل با عنوان P4-SPR  ساخت Affinité Instruments

 

تشخیص آنتی‌ژن، در محل بالین بیمار با روش طیف‌سنجی رامان ارتقا یافته سطحی SERS

طیف‌سنجی رامان ارتقا یافته سطحی، یک روش ارتقا یافته مبتنی بر تشدیدپلاسمون سطحی موضعی (LSPR) و پراکندگی رامان است. این روش امروزه یکی از کاندیدهای پیشرو به‌حساب می‌آید و به‌عنوان یک راه‌حل عملی برای غربالگری سریع بیماری کووید-19 مورد تحقیق و بررسی قرارگرفته است. روش LSPR متکی بر فلزات کمیاب با ساختار نانو است که چگالی بار سطحی را برای تقویت شدت پلاسمون‌های سطحی، به‌صورت موضعی افزایش می‌دهد و باعث افزایش شدت پراکندگی رامان با ضریب 10⁶  می‌شود. این حساسیت فوق‌العاده، با ویژگی‌های ذاتی طیف‌سنجی رامان، طیف سنجی رامان ارتقا یافته سطحی را کاندید غربالگری سریع بیماری کووید-19 در بالین بیمار می‌سازد.

 در حالی‌که برخی از گروه‌ها بر روی تعیین مستقیم اثر انگشت شیمیایی سارس-کووی-2 با استفاده از طیف‌سنجی رامان کار می‌کنند، چالش‌های مربوط به آزمایش، مثل اطمینان از نزدیک بودن آنتی‌ژن به نانوذرات یا زیرلایه نانوساختاری و همین‌طورکاهش پراکندگی رامان از مولکول‌های کوچک‌تر در نمونه، ایجاد آزمایشی تکرارپذیر را تقریبا ناممکن می‌سازد. در نتیجه، یک راهکار معمول‌تر استفاده از سنجش ایمنی ساندویچ SERS  است که مشابه آنچه در الایزا به‌کارگرفته شد، می‌باشد.

سنجش‌های سنتی ساندویچ SERS توسط اولین اتصال آنتی‌بادی‌های ویژه آنتی‌ژن به زیرلایه طلای جامد ایجاد می‌شود. بنابراین، نانوذرات SERS با آنتی‌بادی‌های مشابه و مولکول‌ گزارشکر فعال قوی به لحاظ پراکندگی رامان، پس از آنکه یک فرایند چهار مرحله‌ای اتفاق افتاد عملیاتی می‌شوند.اول زیرلایه در معرض نمونه قرار داده می‌شود، سپس نانوذرات به‌دنبال یک مرحله شستشو، اضافه می‌شوند و در نهایت در معرض لیزر قرار می‌گیرد. اگر نمونه شامل آنتی‌ژن ویروسی باشد، این آنتی‌ژن در نقش اتصال دهنده، نانوذرات عملکردی را به زیرلایه پیوند خواهد داد و طیف رامان مولکول گزارشگر نمایان می‌شود. در حالی‌که فرایند به‌شدت قدرتمند است، قابلیت استقرار میدان را به سبب نیاز مرحله شستشو به قابلیت‌های ریزسیالی محدود می‌سازد. این فرآیند  به سبب ویسکوزیته زیاد بزاق برای آزمایش غیرتهاجمی چالش‌برانگیزتر هم است.

تیم تشخیص بیماری بایو-استریم[8] (دانشگاه ادمونتون،آلبرتای کانادا) یک روش ایمنی سنجی طیف‌سنجی رامان ارتقا یافته سطحی را توسعه دادند که در آن زیرلایه جامد با یک نانوذره پارامغناطیسی جایگزین شده است. این راهکار به‌طور چشمگیری پیچیدگی سیستم را می‌کاهد چرا که نانوذرات طلا و نانوذرات پارامغناطیسی می‌توانند در یک محلول ذخیره شوند. این امکان نیاز به ریزسیالات را حذف می‌کند و به نمونه بزاق اجازه می‌دهد در شیشه نمونه قرارگیرد، هم‌زده شود و سپس توسط میدان مغناطیسی متمرکز شود. شکل 4 یک طرحواره‌ای از سنجش ساندوچی بایو-استریم را نشان می‌دهد که در آن آنتی‌ژن سارس- کووی-2 بین نانوذرات پارامغناطیسی عملیاتی شده و نانوذرات طلا پیوند یافته به مولکول گزارشگر با پیوند کواوالانسی ساندویچ شده است.

شکل 4. نمایش طرحواره کار تیم تشخیص بیماری بایو-استریم با روش طیف‌سنجی رامان ارتقا یافته سطحی(SERS) مغناطیسی که برای تشخیص ویرووس سارس-کووی-2 عملیاتی شده است

  شکل 5   چیدمان آزمایشگاهی را  نشان می‌دهد که در آن یک دانشجوی کارشناسسی ارشد  بیماری‌های عفونی و عضو تیم تحقیقاتی تشخیص بیماری بایو-استریم در دانشگاه بریتیش کلمبیا (در ونکوور، بریتیش کلمبیا، کانادا) به وسیله پیپت در حال انتقال نمونه به یک لوله اپندورف حاوی ترکیب مورد نیاز برای انجام سنجش ساندویچ است. این لوله حاوی ترکیبات مربوط به سنجش ساندویچ، مستقیما روی یک آهنربای نئودیمیوم قرار داده شده است تا نانو ذرات را در پایین ظرف متمرکز ‌کند. سپس توده حاصل با استفاده از چیدمان رامان مدولار مورد تجزیه و تحلیل قرار می‌گیرد. این چیدمان حاوی یک پروب رامان فیبر نوری محصول اینفوتونیک (در نوروود، ماساچوست)، دیود لیزر پایدار شده در طول موج 785 نانومتر متعلق به تیم راهکارهای فوتونیکی نوآورانه (در مونموث جانکشن، نیوجرسی) و یک طیف‌سنج با دمای کنترل شده محصول اوشن اینسایت(اورلند، فلوریدا) است.

شکل 5. آزمایش طیف‌سنجی رامان ارتقا یافته سطحی مغناطیسی که توسط دانشجوی دانشگاه بریتیش کلمبیا اندازه‌گیری می‌شود.

این آزمایش با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی ویروس سارس-کووی-2 ایجاد شده است. این آنتی‌بادی‌ها توسط هاراسیو باخ[9] پژوهش‌گر ارشد تحقیقات تیم تشخیص بیماری بایو-استریم و سرپرست گروه تحقیقاتی،استاد الحاقی و مدیر دانشکده مهندسی آنتی‌بادی و مرکز تحقیقات عفونی و ایمنی پروتئومیک دانشگاه بریتیش کلمبیا توسعه یافته است. با اینکه نتایج تحقیقات این تیم منتشر نشده است، اما حاصل کار آن‎ها چنان امید بخش است که در حال حاضر، مجموعه تشخیص بیماری بایو-استریم 5 نمونه اولیه از سیستم رامان قابل اجرا در بالین بیمار را برای توسعه تجهیزات آزمایش «پی‌سی‌آر» پیشرفته در سراسر کانادا سفارش داده است تا جمع‌آوری داده‌های مقایسه‌ای را شروع کند.

برداشت نهایی

به منظور خلاصه‌سازی مطالب این مقاله، در این نوشتار صرفا بر کاربردهای فوتونیک در آزمایش‌های مربوط به بیماری کووید-19 تمرکز شده است. با این وجود، درک این نکته ضروری است که فوتونیک نقشی بسیار مهم در بسیاری از جنبه‌های مبارزه با بیماری کووید-19 ایفا می‌کند، از سیستم‌های ضدعفونی UV-C گرفته تا درمان فوتودینامیکی[10]. تعیین توالی اولیه ژنوم سارس-کووی-2 بدون روش تعیین توالی  «دی‌ان‌ای» مبتنی بر فلورسانس امکان‌پذیر نیست. در یادداشت‎های ژان فرانسوا ماسون به این نکته اشاره شده است که 15 سال پیش رمزگشایی توالی هفته‌ها طول می‌کشید و 25 سال پیش سال‌ها طول می‌کشید. او ادامه می‌دهد«تنها به سبب نسل بعدی توالی‌یابی بود که توانستیم با تولید واکسن‌ها، یافتن درمان‌ها و دیگر سنجش‌های سبک‌سازی شده واکنش سریع نشان دهیم.» با در نظرگرفتن همه اینها، شکی نیست که فوتونیک راه را برای توانمندسازی این حوزه ادامه خواهد داد؛ نه فقط فناوری‌های نسل آینده مربوط به این همه‌گیری فعلی را پیش خواهد برد، بلکه نقشی حیاتی در مبارزه با عوامل بیماری‌زای آینده که قابل پیش‌بینی هستند خواهد داشت.

منبع:

https://www.laserfocusworld.com/biooptics/article/14188801/optics-and-photonics-enable-the-fight-against-covid19#&gid=1&pid=2

مراجع:

1. L. J. Carter et al., ACS Cent. Sci., 6, 5, 591–605 (2020).
2. R. Chimenti, “Laser-based point-of-care testing and biomodulation therapy have a bright future,” Laser Focus World, 56, 8, 30–32 (Aug. 2020); https://bit.ly/LFW-Chimenti.
3. A. Djaileb et al., ChemRxiv (2020); https://doi.org/10.26434/chemrxiv.12118914.v1.
4. R. Thomas, K. A. Bakeev, M. Claybourn, and R. Chimenti, Spectroscopy, 28, 9, 2–8 (2013).
5. Y. Gerchman, H. Mamane, N. Friedman, and M. Mandelboim, J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 212, 112044 (2020).
6. M. G. Strakhovskaya, G. A. Meerovich, A. N. Kuskov, S. A. Gonchukov, and V. B. Loschenov, Laser Phys. Lett., 17, 9, 093001 (2020).
7. N. Kipshidze, N. Yeo, and N. Kipshidze, Nat. Photonics, 14, 11, 651–652 (2020).

 

[1] reverse-transcription polymerase chain reaction (rt-PCR)

[2]  self-replication DNA

[3] quenching molecule

[4] enzyme-linked immunosorbent  assay(ELISA)

[5] Point-of-care rapid screening

[6] Surface Plasmon Resonance(SPR)

[7] Surface-Enhanced Raman Spectroscopy(SERS)

[8] Bio-Stream Diagnostics

[9] Horacio Bach

[10] Photodynamic therapy