میکروسکوپی لیزری
تعریف: روشی برای تولید تصاویر میکروسکوپی با روبش اشیاء توسط یک لیزر
شکل ۱- چیدمان میکروسکوپی روبش لیزری هم کانون
در بیشتر موارد، روبش لیزری نمونه ها با استفاده از پرتو لیزر پراش محدود[۱] مورد استفاده قرار می گیرد. روبش ممکن است با حرکت دادن پرتو لیزر یا نمونه انجام شود. نوری که حامل اطلاعات بر روی نمونه است به روش های مختلف، مانند پراکندگی از طریق تغییرات قطبش توسط تولید هارمونیک دوم یا توسط فلورسانس برانگیخته (که به آن میکروسکوپی فلورسانس[۲] می گویند)، ایجاد می شود. شدت نوری که از جسم می رسد برای هر نقطه در نمونه ثبت می شود. با استفاده از این داده ها می توان تصاویر را در کامپیوتر تولید کرد و البته امکان ذخیره به شکل الکترونیکی نیز وجود دارد. از روش های عددی می توان برای پردازش تصاویر، مثلاً برای تقویت کنتراست، استفاده کرد. یک تکنیک تصویربرداری که اغلب مورد استفاده قرار می گیرد مبتنی بر یک هندسه هم کانون (میکروسکوپ های روبشی هم کانون[۳]) است، به صورتی که نور متمرکز شده بر نمونه (با شیئی میکروسکوپ) بر روی یک روزنه تصویر می شود. تصویر جایی است که در پشت آن توان اپتیکی تشخیص داده می شود. این هندسه تأثیر نور ناشی از سایر مناطق نمونه، به عنوان مثال نور قبل یا بعد از متمرکز شدن، را می کاهد؛ زیرا چنین نوری نمی تواند به طور مؤثر از سوراخ عبور کند. در واقع، عمدتاً وضوح عمق بهبود پیدا می کند. در این روش اصول هم کانونی در عبارت میکروسکوپی روبش لیزری هم کانون مورد تأکید قرار می گیرد و این مبحث به تفصیل در مقاله های میکروسکوپ های روبشی هم کانون مورد بررسی قرار می گیرد.
به جای فلورسانس ممکن است از اثرات آکوستیک پرتوهای لیزر پالسی استفاده شود. روش حاصل میکروسکوپی اپتوآکوستیک یا فوتوآکوستیک نامیده می شود.
روش هایی برای وضوح زیر- پراش[۴]
پراش در اکثر انواع میکروسکوپ لیزری، شعاع میانه پرتو ممکن برای اسکن پرتو لیزر و در نتیجه وضوح تصویر بدست آمده را محدود می کند. با این حال، برخی از روش ها اجازه می دهند تا حد پراش غلبه پیدا کند. این روش ها گاهی میکروسکوپی فوق وضوح یا نانوسکوپی نامیده می شود. دسته ای از روش ها بر اساس نوردهی غیریکنواخت در ترکیب با پاسخ نوری غیرخطی به دست می آید. میکروسکوپی کاهش گسیل القایی ([۵]STED) (توضیح داده شده در مقاله با میکروسکوپ فلورسانس و مربوط به جایزه نوبل در شیمی ۲۰۱۴) محبوب ترین روش از این نوع است. روش های دیگر بر اساس مولکول های خاص فلورسنت است که ترجیحاً قسمت های خاصی از نمونه را اشغال می کنند و دقیقاً در یک منطقه متمرکز می شوند (میکروسکوپی بازسازی اپتیکی تصادفی، STORM[6]).
پردازش تصویر برای میکروسکوپ های دیجیتال
تصاویر تولید شده با میکروسکوپ های ذکر شده معمولاً با وضوح بالا بر روی صفحه رایانه ها مشاهده می شوند و نه در یک دستگاه اپتیکی؛ این امر باعث می شود چندین نفر به طور همزمان تصاویر را مشاهده کنند.
سپس از رایانه نیز می توان برای اهداف کمکی مختلف استفاده کرد:
- به جای نمایش مقادیر شدت ضبط شده با مقیاس خاکستری، نرم افزارهای نمایشگر می توانند از رنگ های کاذب استفاده کنند. پارامترهای صفحه نمایش مرتبط می توانند در هر زمان که داده های خام نگهداری می شوند، اصلاح شوند.
- اندازه گیری دقیق فاصله ها و اندازه اشیاء بر روی تصاویر نمایش داده شده بر روی صفحه نمایش آسان است.
- پردازش تصویر مبتنی بر نرم افزار از بعضی جهات می تواند کیفیت تصویر مثل کنتراست را افزایش دهد، تصویر را بهبود بخشیده و انحرافات و مصنوعات تصویر ناشی از قطعات اپتیکی را حذف کند.
- نرم افزار می تواند تفاوت بین دو تصویر را شناسایی کند، به عنوان مثال قبل و بعد از برخی تغییرات روی نمونه را مشخص کند.
- تصاویر دیجیتال به راحتی می توانند در مسافت های طولانی کپی، ذخیره و منتقل شوند.
[۱] Diffraction Limited Laser Beam
[۳] Confocal Scanning Microscopes
[۴] Sub-diffraction Resolution
[۵] Stimulated Emission Depletion Microscopy
[۶] Stochastic Optical Reconstruction Microscopy